因此，有必要驗證一種或多種可以替代臨床療效研究的評估方法，以證明生物等效性（BE）。表I總結了測定局部生物利用度（BA）和BE的主要方案，可分為體外和體內方法。表中列出了那些尚未獲得美國FDA正式批準的方法，作為評估外用BA/BE的獨立方法，以及在某種程度上用于比較不同外用藥物產品的其他方法。

在這項研究中，我們參考Leila Bastos Leal 的研究報告，針對戊酸倍他米松（BMV）和抗真菌藥物硝酸益康唑（EN）的配方，考慮了評估外用BE的替代方法，此前已在人體志愿者的體內角質層剝離實驗中進行了檢測。對于BMV，這些制劑是臨時制備的，與公認的血管收縮試驗相比，它們彼此之間明顯不等效，作為陽性對照。以EN為例，膠帶剝離數據證實了臨床試驗的結果，該試驗發現三種乳膏具有生物等效性。這里，兩種藥物的制劑首先使用人工膜進行體外釋放測試，然后使用豬皮膚樣本在離外膠帶剝離方案中進行比較。還進行了一次有限但最終無信息的體外皮膚滲透試驗（同樣使用切除的豬皮膚）。

1.1 配方

制備了兩種配方的戊酸倍他米松（BMV，Sigma Aldrich，Gillingham，UK）制劑，與先前描述的完全相同：（a）溶于中鏈甘油三酯（MCT）（Mygliol 812 N，Synopharm，Barsbüttel，Germany），和（b）溶于微乳液Mikro 100®（ME）（Sebapharma，Boppard，German）。將載體用6%（w/w）Aerosil®200（Sigma Aldrich）增稠成半固體凝膠。將兩種制劑中的BMV濃度調整至藥物溶解度的80%（ME和MCT分別為9.3和1.7 mg mL−1），以提供等效的熱力學活性。

與早期詳細的人體膠帶剝離研究類似（相關閱讀：使用ivrt研究局部作用藥物的體外體內相關性），考慮了三種市售硝酸益康唑（EN）配方（1%w/v）：參考上市產品Fougera®（E.Fougera&Co.，Melville，NY），以及Perrigo（紐約布朗克斯）和Taro（紐約霍桑）的兩種仿制乳膏（在FDA橙色書中列為AB）。

1.2 體外釋放實驗（IVRT）

1.3 體外皮膚滲透

IVPT實驗方法如表3所示，實驗結束后拆卸擴散池，并保留整個接受室溶液用于滲透藥物的分析。

1.4離體膠帶剝離實驗

取1.3中實驗結束后的豬皮，按照下面的要求做離體實驗。

• 對于BMV，首先用干紙巾擦拭，然后使用該干燥擦拭程序，再加上使用兩個連續的70%v/v異丙醇棉簽清潔皮膚表面殘余的制劑。

• 對于EN，皮膚表面清潔程序僅使用酒精棉簽

隨后，對于這兩種藥物，將皮膚牢牢地固定在聚苯乙烯板上，并用模板界定中心區域，其面積等于暴露于制劑的面積。然后，通過膠帶剝離依次去除該部位的角質層（SC）。在膠帶剝離過程之前和整個過程中同時進行的經表皮水分損失（TEWL）。測量表明，大部分SC被去除（此時TEWL已達到100g/m2/h或更高的值）為終點；這樣做所需的膠帶條數約在8至30條之間。

然后，通過用合適體積（在兩種情況下均為1mL）的提取溶劑（對于BMV為40:60v/v乙腈：水，對于EN為純甲醇）震蕩過夜，從粘合劑中提取藥物，來確定每個膠帶條上去除的藥物量。為了優化檢測靈敏度，通常以4個為一組對來自深層SC的膠帶進行分析。

在單獨的一系列EN實驗中，皮膚表面在6小時內清潔殘余制劑后，將組織置于烘箱中（保持在32°C；皮膚的真皮層要充分補水）。再過17小時后，SC膠帶剝離過程完全如上所述進行。這項工作的目的是模擬早期人體體內研究的“藥物清除”期。

1.5 數據分析

1.5.1 IVRT 體外釋放實驗

結果以累積藥物釋放量作為時間的函數表示，并比較了不同配方的行為。評估了描述釋放曲線的最合適函數（例如，線性、t1/2動力學）。

1.5.2離體膠帶剝離

如果在6小時內未檢測到可測量的BMV或EN滲透進入擴散池受體室時，則無需解釋此類數據。

• 對于BMV，在吸收6小時后，整個SC的藥物濃度分布(C作為深度位置x的函數)符合初始無藥物SC表面(x = 0)恒定載藥濃度(Cveh)的Fick第二擴散定律：

以導出SC載體分配系數（K）的值以及藥物的SC擴散率與SC厚度平方的比值（D/L2），如先前工作中所述。此外，使用SC厚度的獨立評估來估計SC上的滲透系數（kp）和穩態通量（Jss）。

• 在EN的情況下，對結果進行了更直接的分析，反映了在人類志愿者中進行的膠帶剝離研究中所采用的方法。在這里，藥物的吸收和清除是由立即或清潔后17小時收集的SC膠帶條中回收的總藥物量來確定的

   

  1.6 統計分析

• 由于本研究的目的不是考慮的兩種藥物的不同配方之間建立生物等效性，因此本研究的體外和體外部分所采用的重復次數并非基于嚴格的冪函數計算。相反，選擇的“n”值與先前體內實驗中使用的值相匹配（BMV的n=6，EN的n=14）。

• 統計分析采用雙尾Student‘s t檢驗和單、雙因素方差分析（ANOVA）以及Bonferroni’s檢驗；p值小于0.05被認為具有統計學意義。

  

  2.1 IVRT實驗結果
  

• 使用BMV制劑的IVRT顯示，沒有可測量量的藥物穿過多孔疏水膜或硅膠膜進入接受室。然而，在親水膜上觀察到BMV釋放。微乳凝膠（ME）在6小時內釋放1430（±161）μg cm−2，而中鏈甘油三酯制劑（MCT）的相應量為7.7（±0.8）μg cm−2。這兩個量的巨大差異可能是由于表面活性劑從ME凝膠中同時擴散，促進BMV在接受室中的溶解所致。對于這兩種制劑，藥物釋放都用典型的時間依賴性平方根來描述。

• 檢測到所用三種膜中每一種膜上所有三種制劑中EN的釋放（圖1）。盡管在6小時內釋放的累積量根據所用的膜而具有顯著差異（ANOVA隨后進行事后測試），但在每個膜內，三種制劑的藥物釋放沒有顯著差異，與產品原設計一致——不同人工膜并不影響藥物是否一致的判斷。

  

2.2 IVPT測試

2.2.1 BMV的IVPT研究結果

在6小時實驗結束時，在接受溶液中未發現BMV，表明在如此短的時間內無論使用何種載體，其都無法穿過皮膚。EN也是如此，這一發現與早期的人體膠帶剝離研究一致，其結果表明滯后時間約為13小時

圖2（左圖）顯示了作為SC內位置的函數的BMV濃度曲線，該曲線是在用凝膠化中鏈甘油三酯（MCT）和微乳液（ME）凝膠制劑處理6小時后通過離體膠帶剝離實驗確定的；在這些實驗中，用干紙巾擦拭皮膚表面。將數據與已發表的人體志愿者體內研究的相應結果（右圖）進行比較

l如上所述導出的分配和表觀擴散參數如圖3所示，以及6小時時進入SC的藥物總量，以及滲透系數和表觀穩態通量的估計值。這些結果再次與早期體內實驗報告的結果進行了比較。對于這兩種制劑，在體外獲得的研究參數與人體研究的參數非常一致（且無顯著差異）；同樣，從志愿者的人體膠帶剝離實驗中觀察到，與MCT制劑相比，微乳液中BMV滲入SC的量和藥物的表觀穩態通量幾乎高出一個數量級（體外8.7倍，體內7.2倍）。

當用異丙醇棉簽更嚴格地清潔皮膚，重復體外實驗時，兩種制劑的Q6h值都降低了約50%（數據未顯示），證實了這種方法是去除殘留制劑的更可靠的方法。

2.2.2 EN的IVPT測試結果

硝酸益康唑（EN）的離體膠帶剝離實驗采用與已發表的人體研究相同的方案進行。重復測定相同數量的SC對藥物的吸收和清除，注意在三種乳膏中暴露6小時后徹底清潔皮膚表面，并確保在膠帶剝離過程中基本上去除所有SC。圖4報告了在6小時滲入和隨后的17小時清除期后從SC中回收的EN的量。

對吸收和清除結果的方差分析表明，所考慮的三種配方之間沒有顯著差異。同樣值得注意的是，對于每種EN乳膏，在吸收和清除期后SC中回收的藥物量之間沒有顯著差異。所得數據的平均值以及上下90%置信區間（C.I.）收集在表II中。

表2 服用三種藥物后服用和清除期SC中EN的平均量（n=14），以及相應的90%置信區間上限和下限（C.I.）

由于所測試的三種乳膏中的每一種的吸收和清除值難以區分，因此使用兩種測試配方（Perrigo和Taro）的平均值與參考配方（Fougera）的[吸收+清除]比率和組合結果評估產品之間的等效性。使用原始數據（圖4）和對數轉換結果進行計算。在0.8至1.25（2，17）的常規范圍內，結果基本相同，總結在表III中

表3 模擬生物等效性評估，基于組合[攝取+清除]數據（n=28），以Fougera為“參考產品”，Perrigo和Taro為“測試”的三種EN cream之間

IVRT結果顯示了所考慮的兩種藥物之間的不同行為。一方面，通過使用的三種不同的人工膜，可以很容易地測量三種測試產品中EN的釋放。此外，不同配方的釋放特性在每個膜上都是相同的。然而，當比較從不同膜獲得的數據時，這些圖譜在定量上沒有重疊，并且穿過親水纖維素屏障的圖譜形狀與穿過兩個疏水膜的圖譜形狀不同（圖1）。對于BMV來說，在6小時內，藥物無法通過兩個疏水膜釋放，推測這反映了藥物在這些人工膜屏障中的高溶解度。相比之下，通過親水纖維素的釋放是可檢測的，并以經典的時間平方根依賴進行，親水膜能夠區分了測試的兩種配方。

從這些實驗中得到的信息應該是明確的，并且在之前就已經被闡明。具體而言，盡管IVRT可以提供關于（例如）不同生產批次一致性的有用質量的控制信息，但僅從這些測量值預測藥物在體內的相對或絕對生物利用度是不明智的。EN數據表明，釋放的量因所用膜的不同而不同，通過膜“傳遞”的量甚至可能遠遠高于僅在同一時期進入SC的量。盡管IVRT顯示的三種EN產品的表觀等效性在體內和體外條帶剝離研究中都得到了反映（并且確實與臨床表現一致），但應根據BMV的結果仔細考慮任何推斷的相關性。對于這種藥物，在兩種情況下，IVRT顯示沒有藥物滲透。因此，單一的人工膜不僅不太可能用于所有藥物的IVRT方法的標準化，而且，即使有，它也能夠模仿在真實皮膚上的任何配方效果（例如，作為滲透促進劑的輔料的作用）。

使用BMV進行的離體SC膠帶剝離實驗顯示出與先前發表的人體研究（圖2和圖3）在定性和定量上表現出非常好的一致性。結果表明，仔細進行的離體皮膚研究（在這種情況下，離體皮膚來自公認的和普遍認為可接受的人體屏障模型可以有效地預測體內情況，如前所述。雖然這一策略不太可能最終演變成任何形式的監管指南，但替代的體外方法在配方開發和優化方面可能具有吸引力。

從與先前發表的人體數據的相關性角度來看，EN離體膠帶剝離研究的結果是混合的。從積極的方面來看，6小時內藥物滲入離體豬皮膚的SC與人體數據完全相關，（正確地）證明了測試的三種藥物產品之間的等效性（表II和III）。相反，盡管研究中清除部分的結果自洽，因為它們也表明了配方的等效性（圖4），但數據與早期的體內觀察有所不同。在體內，在清除階段，益康唑的SC水平降低了約30%，但在離外條件，沒有降低。對這一觀察結果最有可能也是最明顯的解釋是，切除的皮膚缺乏正常的微循環，因此無法提供清除像益康唑這樣的親脂性藥物所需的吸收條件。因此，該活性部分傾向于保留在SC中，并且在去除殘余制劑后的17小時內不會顯著耗盡。這意味著，用于評估局部生物等效性的離體膠帶剝離方法可能無法常規提供關于“皮膚藥代動力學”消除方面的信息，特別是對于具有高log P值的藥物。然而，這并不意味著這些實驗毫無價值；相反，吸收階段的數據對于優化體內實驗的設計以及為臨床評估所考慮的原型制劑的性能提供有價值的見解非常有用。盡管如此，對這里使用的方案做適當修改可能允許這種方法也闡明了清除過程；例如，保持皮膚與大體積的接受室接觸，或使用流通選項，以及使用切除皮膚的較薄部分是值得研究的策略。

總之，本研究的結果證實，IVRT和SC膠帶剝離等技術是表征局部藥物產品性能的可靠方法，有助于活性藥物成分在皮膚中的最終生物利用度。然而，這里使用的每種方法都有上文所述的局限性：

• IVRT可以解決配方質量的特點，但不能報告產品與皮膚的相互作用方式

• SC離體膠帶剝離允許很好地預測體內藥物進入SC的吸收，但是，關于藥物清除率的測定，需要仔細注意實驗設計的優化。